En diciembre de 2019, un grupo de pacientes con neumonía de causa desconocida se relacionó con un mercado mayorista de mariscos en Wuhan, China. Se descubrió un betacoronavirus previamente desconocido mediante el uso de secuenciación imparcial en muestras de pacientes con neumonía. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se usaron para aislar un nuevo coronavirus, llamado 2019-nCoV, que formó otro clado dentro del subgénero sarbecovirus, la subfamilia Orthocoronavirinae. A diferencia de MERS-CoV y SARS-CoV, 2019-nCoV es el séptimo miembro de la familia de los coronavirus que infectan a los humanos. La vigilancia mejorada y la investigación adicional están en curso. 


Los patógenos emergentes y reemergentes son desafíos mundiales para la salud pública. 1 Los coronavirus son virus de ARN envueltos que se distribuyen ampliamente entre los humanos, otros mamíferos y aves y que causan enfermedades respiratorias, entéricas, hepáticas y neurológicas. 2,3 Seis especies de coronavirus son conocidas por causar enfermedades humanas. 4 Cuatro virus – 229E, OC43, NL63 y HKU1 – son prevalentes y típicamente causan síntomas de resfriado común en individuos inmunocompetentes. 4 Las otras dos cepas, el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV), son de origen zoonótico y se han relacionado con enfermedades a veces fatales. 5 5El SARS-CoV fue el agente causal de los brotes de síndrome respiratorio agudo severo en 2002 y 2003 en la provincia de Guangdong, China. 6-8 MERS-CoV fue el patógeno responsable de brotes de enfermedades respiratorias graves en 2012 en el Medio Oriente. 9 Dada la alta prevalencia y la amplia distribución de los coronavirus, la gran diversidad genética y la recombinación frecuente de sus genomas, y el aumento de las actividades de interfaz entre humanos y animales, es probable que los nuevos coronavirus emerjan periódicamente en los humanos debido a frecuentes infecciones entre especies y ocasionales eventos de contagio. . 5,10

A fines de diciembre de 2019, varios centros de salud locales informaron grupos de pacientes con neumonía de causa desconocida que estaban vinculados epidemiológicamente a un mercado mayorista de mariscos y animales húmedos en Wuhan, provincia de Hubei, China. 11 El 31 de diciembre de 2019, el Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC de China) envió un equipo de respuesta rápida para acompañar a las autoridades sanitarias de la provincia de Hubei y la ciudad de Wuhan y realizar una investigación epidemiológica y etiológica. Reportamos los resultados de esta investigación, identificando la fuente de los grupos de neumonía, y describimos un nuevo coronavirus detectado en pacientes con neumonía cuyas muestras fueron analizadas por los CDC de China en una etapa temprana del brote. También describimos las características clínicas de la neumonía en dos de estos pacientes.

Métodos

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL

Se recogieron cuatro muestras del tracto respiratorio inferior, incluido el líquido de lavado broncoalveolar, de pacientes con neumonía de causa desconocida que fueron identificados en Wuhan el 21 de diciembre de 2019 o más tarde y que habían estado presentes en el mercado de mariscos de Huanan cerca del momento de su presentación clínica. Se recogieron siete muestras de líquido de lavado broncoalveolar de pacientes en hospitales de Beijing con neumonía de causa conocida para servir como muestras de control. La extracción de ácidos nucleicos de muestras clínicas (incluidos los cultivos no infectados que sirvieron como controles negativos) se realizó con un kit de ácido nucleico viral de alta pureza, según lo descrito por el fabricante (Roche). Las muestras de ácido nucleico extraídas se analizaron en busca de virus y bacterias por reacción en cadena de la polimerasa (PCR),Se analizaron 12 muestras para detectar 22 patógenos (18 virus y 4 bacterias) como se detalla en el Apéndice complementario . Además, la secuenciación imparcial de alto rendimiento, descrita anteriormente, 13 se usó para descubrir secuencias microbianas no identificables por los medios descritos anteriormente. Se usó un ensayo de PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) para detectar ARN viral mediante el objetivo de una región RdRp consenso de pan β-CoV, como se describe en el Apéndice complementario .

AISLAMIENTO DE VIRUS

Las muestras de líquido de lavado broncoalveolar se recogieron en vasos estériles a los que se añadió medio de transporte de virus. Luego se centrifugaron las muestras para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se inoculó en células epiteliales de las vías respiratorias humanas, 14 que se obtuvieron de muestras de vías respiratorias resecadas de pacientes sometidos a cirugía por cáncer de pulmón y el NGS confirmó que estaban libres de patógenos especiales. 13

Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se expandieron sobre sustrato plástico para generar células de paso 1 y posteriormente se colocaron en placas a una densidad de 2,5 x 10 5 células por pocillo en soportes permeables Transwell-COL (diámetro de 12 mm). Se generaron cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas en una interfaz aire-líquido durante 4 a 6 semanas para formar cultivos polarizados bien diferenciados que se asemejan al epitelio mucociliar pseudoestratificado in vivo. 13

Antes de la infección, las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato; Se inocularon 150 μl de sobrenadante de muestras de líquido de lavado broncoalveolar en la superficie apical de los cultivos celulares. Después de una incubación de 2 horas a 37 ° C, el virus no unido se eliminó lavando con 500 μl de solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos; las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se mantuvieron en una interfaz aire-líquido incubada a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Cada 48 horas, se aplicaron 150 μl de solución salina tamponada con fosfato a las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, y después de 10 minutos de incubación a 37 ° C, se recogieron las muestras. Las células de epitelio mucociliar seudoestratificadas se mantuvieron en este entorno; Las muestras apicales se pasaron en un vial diluido 1: 3 a células nuevas. Las células se monitorizaron diariamente con microscopía óptica, para detectar efectos citopáticos, y con RT-PCR, para detectar la presencia de ácido nucleico viral en el sobrenadante. Después de tres pases, se prepararon muestras apicales y células epiteliales de las vías respiratorias humanas para microscopía electrónica de transmisión.

MICROSCOPIO DE TRANSMISIÓN POR ELECTRONES

Se recolectó el sobrenadante de cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas que mostraron efectos citopáticos, se inactivó con paraformaldehído al 2% durante al menos 2 horas y se ultracentrifugó en partículas de virus de sedimento. El sobrenadante enriquecido se tiñó negativamente sobre rejillas recubiertas con película para su examen. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas que muestran efectos citopáticos se recogieron y fijaron con paraformaldehído al 2% – glutaraldehído al 2,5% y luego se fijaron con tetróxido de osmio al 1% deshidratado con etanol de grado incrustado con resina PON812. Las secciones (80 nm) se cortaron del bloque de resina y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, por separado. Las rejillas teñidas negativamente y las secciones ultrafinas se observaron bajo microscopía electrónica de transmisión.

SECUENCIACIÓN DEL GENOMA VIRAL

El ARN extraído del líquido de lavado broncoalveolar y los sobrenadantes de cultivo se usaron como plantilla para clonar y secuenciar el genoma. Utilizamos una combinación de secuenciación Illumina y secuenciación de nanoporos para caracterizar el genoma del virus. Las lecturas de secuencia se ensamblaron en mapas contig (un conjunto de segmentos de ADN superpuestos) con el uso del software CLC Genomics, versión 4.6.1 (CLC Bio). Posteriormente se diseñaron cebadores específicos para PCR, y se usó RACE 5 ‘o 3’ (amplificación rápida de los extremos de ADNc) para llenar los huecos del genoma de la secuenciación convencional de Sanger. Estos productos de PCR se purificaron de geles y se secuenciaron con un kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v3.1 y un analizador genético 3130XL, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La alineación de secuencias múltiples del 2019-nCoV y las secuencias de referencia se realizó con el uso de Muscle. El análisis filogenético de los genomas completos se realizó con RAxML (13) con 1000 repeticiones de arranque y un modelo general reversible en el tiempo utilizado como modelo de sustitución de nucleótidos.

Para ver el artículo completo dar clic en el siguiente enlace:

https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2001017?query=featured_home